受體菌感覺態(tài)細(xì)胞的制備

受體菌感覺態(tài)細(xì)胞的制備 
 
普通地，新制備的感覺態(tài)細(xì)胞48h后轉(zhuǎn)化速率減低，15d后失去效力。因?yàn)檫@個(gè)，感覺態(tài)細(xì)胞不可以保留太久，4℃保留一周，但-80℃可保留1年。用玻璃管分裝可防止反反復(fù)復(fù)凍熔，損因感觸而悲傷受態(tài)細(xì)胞。

當(dāng)球菌處于容易借鑒外源DNA的狀況時(shí)，即為感覺態(tài)，而用理化手眼使球菌處于感覺態(tài)的操作為致敏過程。感覺態(tài)細(xì)胞制備是重組基因能否成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)緊的技術(shù)環(huán)節(jié)。本嘗試是經(jīng)過鈣離子來引誘使之變成感覺態(tài)細(xì)胞。

材料和辦法

1． 材料：結(jié)腸桿菌

2． 攝譜儀：

離心思，恒溫?fù)u床，恒溫水浴，超凈辦公臺，冷柜

3． 試藥

LB營養(yǎng)物質(zhì)，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高鈷

TFB：10Mm MES（pH6.3）

45Mm MnCl2

10Mm CaCl2

10Mm KCl

操作步驟

結(jié)腸桿菌在LB營養(yǎng)物質(zhì)平板上劃線培育12-16鐘頭，挑取單菌落于LB營養(yǎng)物質(zhì)搖瓶培育結(jié)腸桿菌到對數(shù)期。取1ml培育物7000rpm，離心3min，使聚在一起菌體。再重復(fù)一次。冰浴安放。用預(yù)冷的氯化鎂懸浮菌體7000rpm離心3min。使聚在一起菌體，冰浴安放。用預(yù)冷的氯化鈣懸浮菌體，冰浴15min, 7000rpm離心3min。使聚在一起菌體，冰浴安放。參加200μl預(yù)冷的氯化鈣（或TFB），安放于冰浴，即得感覺態(tài)細(xì)胞，此細(xì)胞可現(xiàn)用，也可施行下步操作。將懸液分裝于無菌離心管中，投入液氮，而后儲于-70℃保留。