雙脫氧氣鏈終止法標(biāo)定DNA序列操作

雙脫氧氣鏈終止法標(biāo)定DNA序列操作 
 
DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸是在3’-OH末端向上行的。因?yàn)?’，3’-雙脫氧氣三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脫氧氣而錯(cuò)過游離-OH，當(dāng)它參入到DNA鏈后，3’-OH末端消逝，使DNA鏈的延伸終止真空干燥箱。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)此原理，將待測(cè)DNA斷片**去單鏈?zhǔn)删wM13載體，并用合成的寡聚核苷酸引物與該載體上**去待測(cè)斷片的上游順著次序退火，隨即在T7DNA聚合酶催化下施行延伸反響。實(shí)際操作中同時(shí)施行，作別終止于A、G、C和T的4個(gè)反響整體體系。每個(gè)反響整體體系均含4種脫氧氣三磷酸核苷酸(dNTP)底物，那里面—種dATP為32P標(biāo)記物，以便能用放射自顯影法讀序。但在這4個(gè)反響整體體系中，作別加一種低液體濃度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，這么ddNTP可隨機(jī)參入正在延伸的DNA鏈上，使鏈延伸終止。例如在“A”管中加ddATP，反響終了時(shí)，管內(nèi)全部新合成的DNA鏈都是以A結(jié)末的不一樣長度的斷片，并且這些個(gè)斷片都帶放射性。將反響物加在高辯白凝膠上電泳，DNA斷片則因其長度不一樣(分子量體積不一樣)被離合電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，短的走在前端，長的泳動(dòng)在后面。其它3管則作別為以G，C或T結(jié)末的不一樣長度DNA斷片。

因?yàn)椋孩倏v然是參差相差一個(gè)核苷酸的DNA斷片，亦可依據(jù)其電泳距離的差別而加以區(qū)別；②A、G、C和T4種反響整體體系的產(chǎn)物在電泳凝膠中相鄰排列。因而在閱覽凝膠電泳的放射自顯影圖像時(shí)，由下至上按前后順著次序即可將DNA的核苷酸順著次序讀出。