酚類化合物的去除

酚類化合物的去除 

 
經(jīng)過Li+或Ca2+沉淀RNA的辦法可以將未被氧氣化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA接合的多酚，可以直接經(jīng)過離心去洗雪，或在苯酚、氯仿抽提時(shí)去掉除掉。在利用高液體濃度的2-丁氧氣酒精（50****）來沉淀RNA時(shí)，因?yàn)槎喾尤芙庥?-丁氧氣酒精中而被去掉除掉。而后用含50**** 2-丁氧氣酒精的緩和沖突液蕩滌RNA沉淀以去除**的多酚。因?yàn)檫@個(gè)縱然多酚被氧氣化，其氧氣化產(chǎn)物仍可以溶解在高液體濃度2-丁氧氣酒精溶液中而被去除，無須再用NaBH4來處置。

多糖的干擾及對(duì)策

多糖的污染是提出取得植物RNA時(shí)不時(shí)碰到的另一個(gè)棘手的問題。植物團(tuán)體中往往富含多糖，而多糖的很多理化性質(zhì)與RNA很相仿，因?yàn)檫@個(gè)很難將他們分開。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了，導(dǎo)致RNA產(chǎn)量的減損；而在沉淀RNA時(shí)，也萌生多糖的凝膠狀沉淀，這種包括多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后萌生粘稠狀的溶液。因?yàn)槎嗵强梢灾萍s很多酶的活性，因?yàn)檫@個(gè)污染了多糖的RNA樣品沒有辦法用于進(jìn)一步的分子生物科學(xué)研討。在常理的辦法中，經(jīng)過SDS-鹽酸胍處置可以局部去除一點(diǎn)多糖；在高液體濃度Na+或K+離子存在條件下，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提可以去掉除掉一點(diǎn)多糖；經(jīng)過LiCl沉淀RNA也可以將局部多糖留在上清液中。但縱然經(jīng)過這些個(gè)步驟仍會(huì)發(fā)覺有相當(dāng)多的多糖與RNA混合摻雜在一塊兒，所以還需求用更管用的辦法來解決植物RNA離合醇化時(shí)多糖污染的問題。

用低液體濃度酒精沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的辦法。在RNA提出取得液或溶液中不迅速參加無薄酒精至終液體濃度10****-30****，可以使多糖沉淀下來，而RNA仍保存于溶液中。普通都是在植物材料的勻漿液中參加酒精，如在從被子植物的木質(zhì)部中提出取得RNA時(shí)，在勻漿上清液中參加酒精至終液體濃度10****以沉淀多糖。但在從蒲桃漿果團(tuán)體中提出取得RNA時(shí)，也可以在用CsCl超離心，酒精沉淀在這以后的RNA溶液中參加終液體濃度30****酒精來沉淀多糖的，進(jìn)一步醇化了RNA樣品。

另一個(gè)常用的辦法是CH3COOH鉀沉淀多糖法。有科學(xué)研究擔(dān)任職務(wù)的人在提出取得云杉團(tuán)體的RNA時(shí)在勻漿上清液中參加1/3大小的5MCH3COOH鉀（pH4.8）溶液以沉淀多糖；一樣也有科學(xué)研究擔(dān)任職務(wù)的人在提出取得酸模植物花團(tuán)體的RNA時(shí)參加的是1/5大小的5MCH3COOH鉀（pH4.8）溶液。這個(gè)之外，在提出取得草棉葉和花粉的RNA時(shí)是加1/3大小的8.5MCH3COOH鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以去掉除掉多糖等雜質(zhì)。也可以在提出取得某些植物材料的RNA時(shí)，是將上面所說的兩種辦法接合運(yùn)用。如在提出取得杧果中果皮的RNA時(shí)，是在勻漿液中參加0.25大小的無薄酒精和0.11大小的5MCH3COOH鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)。不過在去除褐藻的多糖時(shí)，單獨(dú)運(yùn)用酒精或CH3COOH鉀都失效，只有兩者接合運(yùn)用效果最佳。

緩和沖突液中包括高液體濃度的NaCl有助于去除多糖。在提出取得松樹RNA時(shí)，緩和沖突液中NaCl的液體濃度為2.0M和1.0M，經(jīng)過氯仿抽提和酒精沉淀RNA將RNA與多糖離合。也可以將胡羅蔔胚珠等材料苯酚提出取得后的上清液稀釋，調(diào)節(jié)Na+離子液體濃度至80mM，而后參加0.4大小的2-丁氧氣酒精來沉淀去除多糖。

蛋白雜質(zhì)的影響及對(duì)策

氨基酸是污染RNA樣品的又一個(gè)關(guān)緊因素。因?yàn)镽Nase和多酚氧氣化酶亦歸屬氨基酸，故而要取得完整的、高品質(zhì)的RNA就務(wù)必管用地去除蛋白雜質(zhì)。常理的辦法是在冷凍的條件下研磨植物材料以制約RNase等的活性；提出取得緩和沖突液中包括氨基酸改變性別劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基**基溴化銨（CTAB）等，這么在勻漿時(shí)可以使氨基酸改變性別，凝集；有的辦法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質(zhì)。進(jìn)一步可以用苯酚、氯仿抽提去除氨基酸。

額外，也可以利用氨基酸與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不一樣將他們離合。在70****高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大于氨基酸的溶解度，故而將大多氨基酸沉淀下來。繼續(xù)在離心頭清液中參加兩倍大小的無薄酒精，這時(shí)RNA能沉淀下來而能溶于70****高氯酸鈉溶液中的**氨基酸還是留在上清液中。這么可以去掉除掉絕大多的氨基酸。

次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響及對(duì)策

從植物團(tuán)體中提出取得高品質(zhì)RNA的另一個(gè)不容易解決的地方是很多高等植物團(tuán)體特別是成熟團(tuán)體能萌生某些水溶性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物很容易與RNA接合并與RNA并肩被抽提出來而阻攔具備有生命的物質(zhì)活性的RNA的離合。因不可以確認(rèn)這些個(gè)次級(jí)產(chǎn)物具體是啥子事物，所以，到現(xiàn)在為止還沒有啥子特別的辦法來解決這個(gè)問題?？梢跃C合挑選性沉淀法、氯化銫梯度離心法和RNA回借方法醇化了松樹胚珠、成熟松樹針葉等植物團(tuán)體的RNA。

因?yàn)橹参飯F(tuán)體尤其是高等植物團(tuán)體細(xì)胞里外組成成分的復(fù)雜多樣性，要得植物團(tuán)體RNA的提出取得相對(duì)于其他有生命的物質(zhì)材料來說要艱難的多。實(shí)踐中常常會(huì)發(fā)覺，縱然同一栽種物的不一樣團(tuán)體其RNA提出取得辦**有非常大的不一樣；包括某種干擾因素的不一樣植物材料，其適合使用的RNA提出取得辦法有可能不一樣；縱然是同一栽種物同一種團(tuán)體材料，但出處于不一樣基因型植株，其RNA提出取得辦法也有可能不同。所以，對(duì)于某一植物或其團(tuán)體來說，其相應(yīng)的RNA提出取得辦法不可少通過摸索和實(shí)踐能力穩(wěn)固建立。

隨著植物分子生物科學(xué)研討領(lǐng)域的開拓，可以肯定地說，在作為其研討基礎(chǔ)的植物材料RNA提出取得過程中還會(huì)顯露出來新的不容易解決的地方，但隨著不停地考求和經(jīng)驗(yàn)的積累，科學(xué)辦公者們一定會(huì)速?zèng)Q這些個(gè)不容易解決的地方，為植物分子生物科學(xué)的進(jìn)展鋪平道路。